一、实验目的
1. 获取蛋白药物4℃储存前后完整动态表面张力‑时间曲线，对比曲线形态、吸附速率、平衡表面张力变化。
2. 通过张力曲线变化评价4℃低温储存是否引发蛋白构象改变、界面聚集风险，为制剂低温稳定性提供界面表征数据。
3. 建立标准化可复现的Kibron仪器蛋白药物低温胁迫张力测试方法。
二、实验材料与仪器准备
1. 仪器
芬兰Kibron榴莲视频APP下载（EZ‑Pi Plus/Epsilon/Delta‑8），配套原装杆状铂铱探针、温控样品台/96孔测试板，电脑及Kibron采集分析软件；高速离心机，0.22μm低蛋白吸附滤器，4℃冷藏冰箱，超纯水机，pH计，蛋白浓度测定设备。
2. 试剂与样品
待测蛋白药物原液（单抗/重组蛋白等），制剂缓冲液（与药物处方一致），超纯水。所有缓冲液经0.22μm过滤，真空脱气10‑15min，去除溶解气泡，室温备用。
3. 耗材
低吸附离心管、宽口移液枪头，石英样品杯或者96孔测试板，无水乙醇。
4. 仪器前期校验
仪器放置无明显震动位置，避开空调直吹气流，整机通电预热60min。探针依次超纯水冲洗、无水乙醇冲洗，氮气吹干。使用超纯水做张力校准，25℃下纯水表面张力稳定在72.0‑72.8mN/m，确认传感器基线正常，通道之间差值小于0.2mN/m，方可开展实验。测试全程开启防风罩。
三、样品分组与4℃储存处理流程
1. 样品前处理
蛋白药物原液使用对应制剂缓冲液稀释至目标工作浓度，轻柔颠倒混匀，禁止剧烈涡旋，避免剪切诱导蛋白预聚集。10000g室温离心10min，吸取上层澄清80%样品，避开底部潜在沉淀，再经0.22μm低蛋白吸附滤器过滤，去除已有聚集体。测定蛋白浓度，保证各组浓度完全一致。同时准备空白缓冲液对照组，同样过滤脱气处理。
2. 样品分装
将处理后的蛋白药物样品等量分装至若干低吸附离心管，每管体积200‑500μL，减少反复开盖带来的挥发与污染。分为两大组：零时刻对照组（储存前，即刻上机测试）；4℃储存实验组，设置多个储存时间点，例如7d、14d、30d，每个时间点设置3份生物学平行。空白缓冲液同样分装，同步4℃储存。
3. 4℃储存条件
将实验组样品密封避光放入4℃冰箱，冰箱温度稳定，避免温度大幅波动。禁止样品结冰。每个时间点取出对应份数样品，取出后冰上短暂放置，轻柔颠倒3‑5次混匀，不涡旋，离心10000g 10min，取上清，检查目视无浑浊、沉淀，若出现明显浑浊该样品作废。空白缓冲液同步取出做对照。
4. 储存后样品回温平衡
取出的待测样品放置到测试温度环境平衡30min，消除低温带来的温度差，避免上机时温度漂移干扰张力读数。
四、Kibron上机测量操作流程
1. 测试参数设定
软件新建动态张力测试方案，选择时间扫描模式。测试温度统一设置25.0±0.5℃。动态采集总时长设置120‑180min；蛋白吸附慢的样品延长至240min。采集频率设置每2‑5秒一个数据点。探针下降速度2mm/min，探针仅微接触液面，浸入深度0.3mm。每个样品设置3次技术重复。
2. 上样操作（单通道微量杯模式）
取洁净石英样品杯，沿杯壁缓慢加入150‑200μL待测样品，动作平缓，严禁冲击液面产生微小气泡，肉眼观察液面无气泡方可继续，有气泡重新制样。将样品杯平稳卡入温控样品台，关闭防风罩，静置5min，消除移液扰动，等待液面稳定。
若是Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL样品，按排布放入待测样品、储存不同时间点样品、空白缓冲液，加样结束轻轻封板膜避光静置30min，揭膜逐孔检查气泡，存在气泡孔作废，将微孔板卡紧在仪器载板卡槽，确认无晃动。
3. 启动采集
单通道模式，控制探针下降至刚好接触气液界面，点击开始采集，软件自动连续记录表面张力‑时间原始曲线。高通量模式设置扫描顺序，启动批量运行。全部过程不得打开防风罩，防止气流扰动液面。
每完成一个样品测试，探针使用超纯水冲洗3次，无水乙醇冲洗，氮气吹干，再进行下一个样品测试，防止蛋白在探针表面累积污染，造成基线漂移。
4. 空白同步测试
每个储存时间点对应的4℃储存空白缓冲液，与蛋白样品完全相同条件上机，得到缓冲液动态张力曲线，后续用于数据基线扣除。
五、数据处理与指标分析
1. 原始数据导出，扣除对应空白缓冲液的张力基线。
2. 提取关键曲线参数：初始表面张力，张力下降速率（蛋白吸附速率），达到平衡后的平衡表面张力，曲线后期是否出现抬升、震荡、漂移。
3. 对比储存前（零时刻）与4℃储存不同时间点曲线变化。4℃储存后如果蛋白发生构象改变、聚集，通常表现为张力下降速度变快或者变慢，平衡表面张力发生偏移，曲线后期出现抖动、持续漂移。
4. 统计3次生物学平行、3次技术重复，计算平均值和标准偏差。将不同储存时间的曲线叠加绘图，同时记录目视观察结果（是否浑浊、沉淀）。
5. 可配套辅助检测，如SEC‑HPLC检测单体、聚集体含量，辅助解释张力曲线变化，建立界面行为与体相聚集的关联。
六、关键细节与质量控制
1. 全程避免产生气泡，微小气泡会造成曲线噪音与漂移；蛋白样品严禁剧烈震荡涡旋，防止人为引入蛋白聚集。
2. 探针清洁非常关键，蛋白容易吸附在金属探针表面，每次样品之间必须充分冲洗吹干；长时间测试建议间隔用乙醇彻底清洁探针。
3. 保证所有样品蛋白浓度、缓冲液pH、离子强度完全一致，只有储存时间变量，避免其他因素干扰张力结果。
4. 4℃储存期间样品管密封，防止水分挥发，挥发会改变蛋白和缓冲盐浓度，直接造成张力虚假变化。
5. 若样品出现肉眼可见沉淀，该组数据不可采信，需要重新实验。
6. 实验环境温度波动尽量小于±1℃，温度变化会直接改变表面张力数值。
