一、实验目的

1. 使用Kibron榴莲视频APP下载测定不同配方基因递送脂质纳米粒的临界胶束浓度CMC。

2. 完成对应批次脂质纳米粒的细胞转染实验，定量检测转染效率。

3. 分析CMC大小与转染效率之间的相关性，探究界面胶束形成行为对基因递送效果的影响，筛选界面性质适配的脂质纳米粒处方。

4. 建立一套可重复的界面参数‑细胞功能关联评价实验流程。

二、仪器、材料与试剂准备

1. 仪器

芬兰Kibron榴莲视频APP下载，可选EZ‑Pi Plus或者Delta‑8高通量型号，配备铂铱金属探针，温控样品台，配套Kibron分析软件。超纯水机，0.22μm水系有机系滤器，高速离心机，涡旋仪，细胞培养箱，荧光酶标仪或者流式细胞仪，pH计。

2. 试剂与样品

多组不同处方基因递送脂质纳米粒LNP储备液，包含不同可电离脂质比例、辅助脂质比例的配方，LNP包裹核酸（mRNA/siRNA）。LNP稀释介质，一般为无血清培养基或者PBS缓冲液，根据体内外应用场景确定。细胞培养用培养基，胎牛血清，转染用细胞，核酸表达检测相关试剂。全部缓冲液提前真空脱气10‑15min，0.22μm过滤除去杂质和微气泡。

3. 耗材

低吸附离心管，石英样品杯或者Kibron专用96孔微孔板，无水乙醇，移液枪低吸附枪头。

4. 仪器校验准备

仪器放置于无震动、避开直吹气流的实验台面，整机通电预热60min，全程关闭防风罩。铂铱探针依次超纯水冲洗，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。使用25℃超纯水做张力校准，纯水表面张力稳定72.0‑72.8mN/m，通道之间偏差小于0.2mN/m，确认基线稳定后，方可开展样品测试。测试温度固定25.0±0.5℃。

三、脂质纳米粒样品梯度稀释制备

1. 确定浓度梯度范围。根据预实验结果设置足够宽浓度区间，覆盖远低于CMC到远高于CMC区间，设置12‑16个浓度梯度点。高浓度端从LNP母液开始，逐级2倍梯度稀释。梯度稀释介质必须和后续测试介质完全统一。

2. 稀释操作全部使用低吸附离心管，移液操作轻柔，避免剧烈涡旋产生气泡。每一个稀释点充分颠倒混匀，禁止高速震荡。配好的梯度样品室温静置平衡30min，让脂质胶束充分完成界面平衡。

3. 每个浓度梯度设置2份平行样品。同步准备空白稀释介质对照组，用于后续基线扣除。所有样品目视检查，无可见沉淀、无气泡，出现气泡的样品需要重新配制。

四、Kibron动态表面张力测定CMC操作流程

1. 软件参数设置。新建静态/动态表面张力测试程序，选择时间扫描模式，测试温度25℃。每个浓度样品采集时间设置30‑60min，保证表面张力达到平衡。采集间隔2‑5秒每点，探针浸入深度控制0.3mm，探针下降速度2mm/min。

2. 单通道石英杯上样。取150‑200μL样品，沿着杯壁缓慢加入石英样品杯，避免冲击液面产生气泡。将样品杯放置温控台，关闭防风罩静置5min，消除上样扰动。控制探针下降接触气液界面，启动采集，等待张力数值完全稳定，记录平衡表面张力。

如果使用Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL梯度样品，小心避免产生气泡，微孔板放置静置30min，检查孔内气泡，有气泡孔舍弃，将微孔板固定卡槽，启动批量自动测试。

3. 样品间探针清洗流程。每完成一个浓度点测试，探针超纯水冲洗3次，无水乙醇冲洗，氮气吹干，再进行下一样品，防止脂质吸附残留造成交叉污染。

4. 所有梯度浓度全部完成测试，同步完成空白介质测试，导出全部平衡表面张力原始数据。

五、细胞水平转染效率测定

1. 使用同一批次，同一稀释介质的LNP样品，进行细胞转染实验。细胞提前铺板，细胞汇合度控制在合适范围，按照实验方案设置复孔，每个LNP配方设置3个生物学复孔。

2. LNP按照实验设定的给药浓度加到细胞孔板，按照标准细胞转染流程孵育培养。孵育结束后，按照检测方案处理细胞。

3. 转染效率检测，若是荧光报告基因，使用流式细胞仪统计阳性细胞比例，或者酶标仪检测荧光强度；非荧光核酸可以采用qPCR、蛋白免疫印迹等手段定量核酸表达水平。记录每个配方的转染效率数值，同时记录细胞毒性数据作为辅助参考。

六、数据处理与CMC‑转染效率关联分析

1. 将Kibron导出的原始数据，扣除空白介质基线，提取每个LNP浓度对应的平衡表面张力。以脂质总浓度为X轴，平衡表面张力为Y轴绘制曲线。

2. 曲线会出现两段折线，高浓度区间表面张力不再明显下降，两段直线交点对应的浓度即为CMC临界胶束浓度。每个配方平行样计算CMC平均值以及偏差。

3. 将各个LNP配方得到的CMC数值，与对应批次测得的细胞转染效率数据进行匹配。绘制CMC‑转染效率散点图，进行相关性分析。

4. 结果判断逻辑。CMC数值高低代表脂质形成胶束的能力。CMC偏低代表脂质更容易形成胶束；CMC过高，脂质不容易形成胶束，游离脂质占比高，可能带来细胞毒性，影响转染。对比不同处方，判断是低CMC对应更高转染效率，还是存在最优CMC窗口。

5. 同步记录LNP理化表征，粒径、Zeta电位、包封率，辅助解释CMC与转染效率之间的变化关系，区分是CMC本身带来的效应还是粒径包封率干扰。

七、关键细节与质量控制

1. 梯度稀释介质必须统一，pH、离子强度严格保持一致，缓冲体系变化会直接改变CMC测定结果。

2. 脂质极易吸附在金属探针表面，探针清洗步骤不可省略，高浓度LNP测试结束后，必要时乙醇浸泡探针去除脂质残留。

3. 气泡会严重干扰表面张力读数，配样、上样全程严防气泡，出现气泡必须重新制备样品。

4. CMC测试和细胞转染必须使用同一批次LNP，间隔时间尽量缩短，避免LNP储存降解、粒径变化，造成两组数据不匹配。

5. LNP样品避免强光长时间照射，防止脂质氧化降解。

6. 环境温度波动控制±1℃以内，温度会改变CMC与表面张力结果。