一、实验目的

1. 建立Kibron仪器在35%高盐条件下的表面张力标准化测试流程，规避高盐体系盐析结晶、基线漂移、盐离子本底干扰问题。

2. 测定海洋耐盐菌发酵液动态表面张力，评价菌株在高盐环境下产生物表面活性剂的能力。

3. 通过高盐基质空白校正，扣除35%盐溶液本身带来的表面张力变化，区分盐离子效应和微生物代谢产物的界面效应。

4. 形成可复现的高盐微生物发酵液界面表征方法，用于极端耐盐菌株的筛选与发酵条件优化。

二、仪器材料与试剂准备

1. 仪器

芬兰Kibron榴莲视频APP下载，EZ‑Pi Plus单通道或者Delta‑8高通量机型，配备DyneProbe铂铱探针，温控样品台，配套Kibron分析软件。高速离心机，真空脱气装置，pH计，超纯水机。

2. 试剂与样品

海洋耐盐菌发酵液，氯化钠，配置35%(w/v)高盐基质溶液。35%高盐空白基质，除不接种菌株以外，其余培养基组分、盐浓度、pH与发酵体系完全一致。全部溶液配制完成后真空脱气10‑15min，除去溶解气体。

3. 耗材

PTFE材质样品杯，优先选用货号3640，耐高盐腐蚀；96孔测试选用耐盐DynePlate微孔板，低吸附离心管，无水乙醇，0.22μm水系滤膜，滤膜提前用35%高盐基质润洗，降低滤膜对表活物质的吸附损失。

4. 仪器校验准备

仪器放置在无震动、无空调直吹的实验台面，整机通电预热60min，关闭防风罩。铂铱探针依次超纯水冲洗，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。首先用25℃超纯水做基础张力校准，纯水表面张力稳定72.0‑72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，确认仪器硬件基线正常。测试温度固定25.0±0.5℃。

高盐体系不要直接用高盐溶液做仪器硬件零点标定，硬件标定统一使用超纯水，高盐的本底效应依靠后续基质空白进行校正。

三、样品与高盐空白基质制备

1. 菌株培养取样。海洋耐盐菌在35%盐浓度培养基中进行摇瓶发酵，设置对应的培养温度、转速，设置3份生物学平行。分别在0h、24h、48h、72h等时间节点取样。

2. 样品预处理。取得的发酵菌液8000g离心20min，去除菌体沉淀，吸取上清。上清液经过预先润洗的0.22μm滤膜过滤，去除残留菌体与颗粒杂质，得到澄清发酵上清液。过滤操作轻柔，禁止剧烈震荡，避免产生气泡。

3. 35%高盐空白基质制备。按照发酵培养基配方，配制不含菌株的35%盐空白培养基，和实验组同步摇床孵育相同时间，经过同样离心、过滤操作，得到高盐基质空白溶液。用于扣除盐离子、培养基组分带来的本底张力。

4. 样品平衡处理。过滤后的发酵上清与高盐空白基质，室温静置平衡30min，目视检查无结晶析出、无气泡。35%盐体系溶解度有限，低温容易析出盐结晶，样品全程避免降温。样品现配现测，4℃存放会析出氯化钠晶体，禁止冷藏保存。

四、Kibron上机完整操作流程

1. 软件参数设置。新建动态表面张力时间扫描程序，测试温度25℃，总采集时间设置90‑120min，保证表面张力达到稳定平台。采集间隔2‑5秒每数据点，探针下降速度2mm/min，探针浸入液面深度0.3mm。每个样品设置2次技术重复。

2. 上样操作，单通道PTFE样品杯模式。沿杯壁缓慢加入150‑200μL待测样品，动作平缓，不能冲击液面，防止产生气泡。将样品杯放置温控样品台，关闭防风罩静置8‑10min，消除移液扰动，等待液面稳定。探针下降接触气液界面，启动采集，记录完整动态张力‑时间曲线。

如果使用Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL样品，检查孔内无气泡、无盐结晶，将微孔板卡紧固定，空白基质和待测样品排布于同一块板，启动批量自动测试。

3. 高盐样品之间探针清洗流程。35%高盐溶液极易在探针表面蒸发析出盐结晶，盐晶会造成读数严重失真。每完成一个高盐样品测试，探针使用大量超纯水冲洗5次，充分溶解探针表面附着盐分，再用无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。测试完高盐样品后，增加一步纯水30min浸泡清洗，去除探针缝隙残留盐分。

4. 测试顺序安排。先测试超纯水基线空白，再测试同批次35%高盐基质空白，之后测试各个时间点的耐盐菌发酵上清样品。全部样品测试结束后，再次复测超纯水，确认探针没有盐残留污染。复测纯水张力偏差大于0.2mN/m，说明探针残留盐分，本组全部数据作废，探针重新深度清洗复测。

五、数据处理与空白校正步骤

1. 导出全部原始动态张力数据，查看首尾两次超纯水基线，确认探针没有盐结晶污染。基线漂移超过0.2mN/m，需要重新清洗探针再实验。

2. 获取35%高盐基质空白完整动态张力曲线，该曲线包含高盐本身、培养基组分带来的表面张力变化，不可以使用纯水做扣除。

3. 将发酵上清原始张力曲线，减去同批次35%高盐基质空白曲线，得到校正后的动态表面张力曲线。校正后得到的张力下降才是微生物代谢生物表面活性剂带来的真实界面效应。

4. 提取校正之后的关键参数，初始表面张力，平衡表面张力，张力下降速率。统计生物学平行与技术平行的平均值和标准偏差。

5. 对比不同发酵时间点校正后的张力变化，评价耐盐菌株在35%高盐条件下产表活能力。同时记录样品pH，作为辅助参考指标。

六、关键细节与质量控制

1. 35%氯化钠体系溶解度有限，样品温度降低会析出盐晶体，样品、样品杯、探针都不能遇冷，全程室温操作，禁止冷藏样品。一旦出现盐结晶，该样品直接作废。

2. 盐会随溶剂挥发在探针表面结晶，探针清洗步骤必须严格执行，高盐样品不能多个连续测试不清洗探针。实验结束探针必须纯水充分浸泡冲洗，去除缝隙内残留盐。

3. 不能用纯水代替35%高盐基质空白进行数据扣除。高浓度盐离子本身会改变水溶液表面张力，直接用纯水扣会造成结果严重虚高。

4. 滤膜必须提前用35%高盐基质润洗，避免滤膜吸附生物表面活性剂，造成测得张力变化偏小。

5. 全程严防气泡，高盐溶液粘度变化，微小气泡不容易消散，气泡会带来曲线剧烈抖动，出现震荡曲线优先排查气泡问题，重新制样。

6. 环境温度波动控制±1℃以内，温度变化既影响盐溶解度，也会改变表面张力读数。

7. 不建议长时间连续动态采集超过120min，长时间测试液面溶剂挥发，盐浓度会进一步升高，带来持续漂移，如需更长时间实验，需要评估挥发带来的误差。