一、实验目的

1. 建立Kibron仪器对微量植物根系浸出液直接检测的标准化操作流程，避免浓缩步骤造成根际活性组分变性、损失。

2. 测定不同处理条件下植物根际分泌物动态表面张力，获取初始张力、吸附速率、平衡表面张力等参数，评价根际分泌物界面活性。

3. 通过严格基质空白校正，扣除浸提溶剂、培养介质带来的本底干扰，区分溶剂效应与根系分泌产物的真实界面作用。

4. 实现小体积浸出液样品的可重复测试，适用于幼苗、小型植株根际分泌物的界面性质评价。

二、仪器材料与试剂准备

1. 仪器

芬兰Kibron榴莲视频APP下载，优先选用EZ‑Pi Plus单通道或者Delta‑8高通量机型，配备DyneProbe铂铱探针，温控样品台，配套Kibron数据分析软件。高速冷冻离心机，真空脱气装置，pH计，超纯水机。Delta‑8更适配微量体积样品，单通道需选用PTFE微量样品杯，货号3640。

2. 试剂与样品

待测植物根系浸出液，根际浸提溶剂（超纯水或者弱盐溶液，根据实验方案确定）。同步制备无植株处理的浸提溶剂空白，以及基质空白，经过与样品完全一致浸提、孵育、离心过滤流程。全部溶剂提前真空脱气10‑15min。

3. 耗材

低吸附离心管，Kibron PTFE微量样品杯或者DynePlate 96孔微孔板，无水乙醇，0.22μm低吸附水系滤膜，低吸附移液枪头。滤膜使用浸提溶剂提前润洗，减少分泌物中表活类物质被滤膜吸附。

4. 仪器校验准备

仪器放置于无震动、无空调直吹气流的台面，整机通电预热60min，关闭防风罩。铂铱探针依次超纯水冲洗，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。25℃超纯水开展张力校准，纯水表面张力稳定72.0‑72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，基线稳定无漂移。测试温度固定设置25.0±0.5℃。

微量样品测试前确认探针无变形，探针尖端弯折会造成微量液面接触异常，直接导致数据失效。

三、根系浸出液样品制备

1. 根际分泌物浸出操作。按照实验设计完成植株培养，采用浸提法收集根系浸出液，控制浸提体积，获得小体积浸出样品。设置空白对照组，不放置植物植株，其余浸提条件、溶剂、时间、温度完全一致，用于扣除溶剂、培养基质溶出物带来的背景。

2. 样品预处理。收集得到的根系浸出液，4000g冷冻离心15min，去除根系碎屑、土壤颗粒、微生物菌体。小心吸取上层清液。上清液使用预先润洗的0.22μm低吸附滤膜过滤，除去微小颗粒。全程禁止剧烈震荡，防止产生气泡，同时避免剪切造成部分活性组分结构改变。

3. 样品分组。分为根系浸出液待测样品，浸提溶剂空白，基质浸出空白。每个植株处理设置3份生物学平行。样品体积满足单通道150‑200μL，高通量模式每孔50μL。样品现制现测，根际分泌物中部分活性物质稳定性差，不宜长时间储存，如需短时间保存，4℃避光存放不超过12h，上机前恢复至室温。

4. 样品平衡。过滤后的样品以及空白，室温静置平衡30min，目视检查无沉淀、无气泡，出现气泡需要重新制样。

四、Kibron微量样品上机完整操作流程

1. 软件参数设置。新建动态表面张力时间扫描程序，测试温度25℃。根际分泌物活性物质浓度通常偏低，界面吸附慢，总采集时长设置120‑180min。采集间隔2‑5秒每数据点，探针下降速度2mm/min，探针浸入液面深度控制0.3mm。每个样品设置2次技术重复。

2. 单通道PTFE微量样品杯上样。沿杯壁缓慢加入150‑200μL根系浸出液，液体量不可过少，液面高度不足会造成温控偏差以及探针接触异常。加样动作轻柔，避免冲击液面产生气泡。将样品杯放置温控样品台，关闭防风罩，静置8‑10min，消除移液扰动，等待液面完全稳定。探针下降接触气液界面，启动采集，记录完整动态张力‑时间曲线。

如果使用Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL样品，加样过程避免触碰孔壁液面，加样完成检查孔内无气泡，将微孔板卡紧固定，待测样品与两类空白排布在同一块微孔板，保证温度环境条件一致，启动批量自动测试。

3. 探针清洗流程。每完成一个微量样品测试，探针超纯水冲洗3次，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。根际分泌物含有有机酸、多糖、类表面活性物质，极易吸附在探针金属表面，清洗不充分会带来交叉污染，造成后续样品基线偏移。全部样品测试结束后，探针乙醇短暂浸泡，再冲洗吹干保存。

4. 测试顺序。先测定超纯水基线空白，确认仪器状态正常，之后测定基质浸出空白、浸提溶剂空白，最后测定各组根系浸出液样品。全部测试结束复测超纯水，确认探针没有吸附残留。复测纯水张力偏差大于0.2mN/m，代表探针存在吸附污染，本组数据作废，探针深度清洗后重新实验。

五、数据处理与空白校正步骤

1. 导出全部原始动态张力数据，对比实验前后两次超纯水基线，判断探针是否存在污染残留。基线漂移超过0.2mN/m，数据不可采信。

2. 区分两级空白，浸提溶剂空白反映溶剂本身的张力；基质浸出空白反映培养基质溶出物质带来的界面效应。优先选用基质浸出空白作为主要扣除空白，不可以直接使用纯水进行数据扣除。

3. 将根系浸出液原始张力曲线扣除同批次基质浸出空白曲线，得到校正后的动态表面张力曲线。校正后得到的张力下降，才是植物根系分泌产物产生的真实界面响应。

4. 提取校正后关键参数，初始表面张力，平衡表面张力，张力下降速率。分别计算生物学平行和技术平行的平均值以及标准偏差。

5. 对比不同植株处理组校正后的张力变化，评价根际分泌物界面活性高低。同步记录样品pH，作为辅助参考信息。

六、关键细节与质量控制

1. 本方案为浸出液直接检测，不进行浓缩。禁止离心浓缩、旋转蒸发等处理，浓缩会造成多糖、有机酸等组分变性或者损失，改变真实界面行为。样品浓度极低时，张力变化幅度小，需要足够长采集时间等待界面吸附达到平衡。

2. 微量样品对挥发敏感，长时间测试会发生溶剂挥发，造成样品组分浓度虚高。采集时间尽量不超过180min，环境湿度尽量维持40‑60%，降低挥发带来的干扰。

3. 滤膜必须使用浸提溶剂提前润洗，根际微量活性物质很容易被滤膜吸附，造成测得的张力变化被低估。

4. 全程严防气泡，微量体系中气泡很难肉眼分辨，如果曲线出现无规则高频抖动，优先判定存在气泡干扰，需要重新制备样品。

5. 环境温度波动控制在±1℃以内，温度变化会直接改变表面张力读数。实验台面避免震动，震动会干扰微量液面，造成曲线噪音增大。

6. 根际浸出液容易滋生微生物，样品放置时间过长微生物增殖会改变组分，样品必须现制备现检测。