一、实验目的
1. 建立Kibron仪器对河道底泥微生物EPS微量提取液直接检测的标准化操作流程，避免浓缩、烘干等前处理对EPS中蛋白、多糖、腐殖类活性组分的破坏。
2. 测定不同点位、不同环境条件河道底泥EPS提取液的动态表面张力，获取初始张力、吸附速率、平衡表面张力，评价EPS界面活性。
3. 通过多级空白校正，扣除EPS提取试剂、底泥基质溶出物带来的本底干扰，分离提取试剂效应与EPS真实界面作用。
4. 适配小体积EPS提取液样品，实现多组底泥样本平行比对，用于底泥微生物界面行为、污染物界面迁移相关研究。
二、仪器材料与试剂准备
1. 仪器
芬兰Kibron榴莲视频APP下载，可选EZ‑Pi Plus单通道或者Delta‑8高通量机型，DyneProbe铂铱探针，温控样品台，配套Kibron分析软件。高速冷冻离心机，恒温水浴，真空脱气装置，pH计，超纯水机。单通道选用货号3640 PTFE微量样品杯，高通量使用DynePlate 96孔微孔板。
2. 试剂与样品
河道底泥样品，EPS提取试剂（热提取、阳离子交换树脂法对应试剂，根据实验方法确定）。同步制备全程不加底泥的试剂空白，以及灭活底泥基质空白，与样品经历完全一致提取、孵育、离心过滤全套流程。所有提取用试剂提前真空脱气10‑15min。
3. 耗材
低吸附离心管，无水乙醇，0.22μm低吸附水系滤膜，低吸附移液枪头。滤膜使用对应EPS提取试剂提前润洗，降低多糖、蛋白类EPS组分被滤膜吸附造成损失。
4. 仪器校验准备
仪器放置无震动、远离空调直吹的实验台面，整机通电预热60min，关闭防风罩。铂铱探针依次超纯水冲洗，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。检查探针尖端无弯折变形，微量检测探针变形会造成液面接触异常，数据失效。25℃超纯水开展张力校准，纯水表面张力稳定72.0‑72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，基线稳定无漂移。测试温度固定25.0±0.5℃。
三、河道底泥EPS微量提取液样品制备
1. EPS提取操作。取河道底泥，按照选定的标准EPS提取方法开展提取，阳离子交换树脂法或者热提取法，严格控制提取温度、时间、固液比。设置两组空白，第一组为试剂空白，只加入提取试剂，不加底泥，其余提取操作完全相同。第二组为灭活底泥基质空白，底泥高温灭菌灭活后，加入同等提取试剂，同步全套提取流程，用于扣除底泥本身溶出非生物组分干扰。每个底泥采样点设置3份生物学平行。
2. 样品预处理。提取完成后的混合体系，高速冷冻离心，转速与时间按照EPS提取标准执行，去除底泥颗粒、菌体残渣，小心吸取上层EPS提取液。吸取得到的提取液使用经过润洗的0.22μm低吸附滤膜过滤，去除细小颗粒杂质。全程避免剧烈涡旋震荡，防止剪切破坏EPS高分子结构，同时避免产生气泡。
3. 样品分组。分为底泥EPS待测提取液、灭活底泥基质空白、试剂空白。单通道测试样品体积保证150‑200μL，Delta‑8高通量每孔50μL。EPS组分稳定性有限，样品现提现测，不得长时间存放，若需短暂保存，4℃避光放置不超过12h，上机前取出恢复至室温。
4. 样品平衡。过滤完成的待测样品与两类空白，室温静置平衡30min，目视检查无沉淀、无气泡，存在气泡的样品需要重新制备。
四、Kibron微量提取液上机完整操作流程
1. 软件参数设置。新建动态表面张力时间扫描程序，测试温度25℃。底泥EPS以多糖、蛋白、腐殖质为主，界面吸附速度偏慢，总采集时长设置120‑180min，保证张力达到平衡平台。采集间隔2‑5秒每数据点，探针下降速度2mm/min，探针浸入液面深度0.3mm。每个样品设置2次技术重复。
2. 单通道PTFE微量样品杯上样。沿杯壁缓慢加入150‑200μL EPS提取液，液面高度不能过低，防止温控异常以及探针接触失败。加样动作平缓，避免冲击液面带入气泡。将样品杯放置温控样品台，关闭防风罩，静置8‑10min，消除移液扰动，等待液面稳定。探针下降接触气液界面，启动采集，记录完整动态张力‑时间曲线。
如果使用Delta‑8高通量96孔板模式，每孔加入50μL样品，加样时不要触碰孔内液面。加样结束检查孔内无可见气泡，将微孔板卡紧固定。待测样品、灭活底泥基质空白、试剂空白排布在同一块微孔板，保证温度环境条件一致，启动批量自动测试。
3. 探针清洗流程。每完成一个微量EPS样品测试，探针超纯水冲洗3次，无水乙醇冲洗，高纯氮气吹干。EPS中的蛋白、腐殖质极易吸附在铂铱探针表面，清洗不充分会造成交叉污染，基线发生偏移。全部样品测试结束，探针使用乙醇短暂浸泡，再冲洗吹干保存。
4. 测试顺序。先测定超纯水基线空白，确认仪器硬件状态正常，之后依次测定试剂空白、灭活底泥基质空白，最后测定各组底泥EPS提取液样品。全部测试结束复测超纯水，确认探针没有吸附残留。复测纯水张力偏差大于0.2mN/m，判定探针存在吸附污染，本组数据作废，探针深度清洗后重新开展实验。
五、数据处理与空白校正步骤
1. 导出全部原始动态张力数据，对比实验前后两次超纯水基线，评估探针污染情况，基线漂移超过0.2mN/m，数据不可采信。
2. 两级空白区分，试剂空白反映提取试剂本身的表面张力；灭活底泥基质空白反映底泥非生物溶出物带来的界面效应，实验优先选用灭活底泥基质空白作为主要扣除空白，不可直接使用纯水进行数据扣除。
3. 将EPS提取液原始张力曲线扣除同批次灭活底泥基质空白曲线，得到校正后的动态表面张力曲线。校正后得到的张力下降，才是微生物EPS组分带来的真实界面响应。
4. 提取校正后关键参数，初始表面张力，平衡表面张力，张力下降速率。分别计算生物学平行、技术平行的平均值以及标准偏差。
5. 对比不同点位底泥EPS校正后的张力变化，评价EPS界面活性高低。同步记录样品pH，作为辅助参考信息。
六、关键细节与质量控制
1. 本方案为微量提取液直接检测，禁止使用旋转蒸发、超滤浓缩等手段富集样品。浓缩会造成EPS蛋白变性、多糖聚集，改变原有界面行为。EPS浓度偏低时张力变化幅度较小，必须保证足够采集时长，等待界面吸附达到平衡。
2. 微量样品长时间测试存在溶剂挥发问题，采集时间尽量不超过180min，环境湿度维持40%‑60%，降低挥发带来的浓度漂移。
3. 滤膜必须使用对应EPS提取试剂提前润洗，EPS的蛋白、多糖组分容易被滤膜吸附，会低估样品真实界面活性。
4. 全程严防气泡，微量体系气泡不易肉眼识别，曲线出现无规则高频抖动，优先判定气泡干扰，需要重新制备样品。
5. 实验环境温度波动控制在±1℃以内，台面严格防震，震动会干扰微量液面，增大曲线噪音。
6. EPS提取液含有丰富有机质，极易滋生微生物，样品提取完成后尽快测试，存放时间过长微生物增殖会改变EPS组分，造成结果失真。
